尽管双特异性抗体已在临床上取得了一定的成功，但仍然存在许多障碍，如剂量、治疗耐药性和对实体瘤的适度疗效。为了克服这些限制，人们已致力于多特异性抗体的开发，开辟了新的途径来解决癌症的复杂生物学问题和增加抗肿瘤免疫反应。作为BsAb的一种进化形式，三/四特异性抗体在最近几年受到了广泛关注和开发。目前，大约有20个具有三/四特异性的分子实体处于治疗血液瘤或实体瘤的早期临床试验阶段（表1）。这些进展反映了人们对多特异性抗体领域日益增长的兴趣。
图1. 进入临床阶段的三/四特异性的分子
与BsAb类似，目前三特异性抗体（TsAb）可根据其与常规IgG结构的相似性分为IgG-like形式(有Fc区)和non-IgG-like形式(无Fc区)(图1)。
图1. 多特异性抗体的结构示意图
TsAb的主要应用领域仍然是肿瘤学，在大多数设计中，特异性之一旨在结合T或NK细胞，之二主要靶向至少一种TAA。
大多数 TsAb被设计同时靶向两个肿瘤相关抗原以提高肿瘤细胞的选择性，减少免疫逃逸。与传统的单一TAA靶向TCE（T cell engagers）相比，双TAA靶向可能有助于防止由于选择性压力导致的抗原丢失进而肿瘤逃逸，并可能有助于克服抗原异质性。例如，为了潜在地克服CD19抗原逃逸，在一项研究工作中，Zhao等人通过将抗CD19单链抗体和抗CD22单域抗体融合到CD3抗体中，设计了CD19/CD22/CD3 TsAb。结果发现，TsAb在体外对CD19+和/或CD22+肿瘤细胞具有更好的诱导T细胞特异性细胞毒作用和细胞因子的产生，并且在患者来源的B-ALL异种移植(PDX)模型中，与相应的BsAb单独或联合使用相比，TSAb显示出显著增强的抗肿瘤效果。并且值得注意的是，除了TsAb治疗组外，所有动物都观察到白血病复发。
一些TsAb被设计成靶向两种T细胞共刺激受体和/或检查点受体。因为为实现最佳的激活和T细胞增殖，通常需要伴随着共刺激信号。此外，激活的T细胞反过来表达抑制性检查点受体来控制免疫反应。因此，设计包括共刺激分子激动剂或检查点受体拮抗剂以及抗CD3和抗TAA部分的三特异性TCE构成了一个吸引人的策略。例如Sanofi开发了具有共刺激受体CD28的TsAb：SAR442257 (CD38/CD3/CD28)和SAR443216(HER2/CD3/CD28)，目前已进入临床研究。
一些三特异性TCE的类型还包括与单个TAA和单个T细胞激活受体结合的结构域，以及增加血清半衰期的部分。因为基于小片段抗体的TsAb，如scFv和sdAb，其分子量较小，易被肾脏过滤清除。比如55 kDa的BsAb Blinatumomab血清半衰期只有2小时，因此需要持续静脉输注。白蛋白结合的sdAb是一种广泛应用于延长半衰期的策略。延长半衰期的最大优势是药物浓度更均匀，给药频率更低，并且有可能在不影响治疗效果的情况下减少剂量。目前正在进行临床试验的相当大比例的TsAb已经使用这种策略延长了半衰期。例如Harpoon Therapeutics开发了四个已进入临床阶段TsAb：HPN217（BCMA/HSA/CD3）、 HPN328（DLL3/HSA/CD3）、HPN424（PSMA/HSA/CD3）、HPN536（MSLN/HSA/CD3）。
一种扩大TsAb治疗窗口的有趣方法是条件性的激活TCE，其作为非活性前体药物给予，旨在延长释放(避免CRS)或肿瘤限制性激活(避免靶点外的肿瘤副作用)。一个经典的例子是TriTAC-XR平台，它在体循环中慢慢激活，降低最大药物浓度并延长给药间隔，类似于皮下给药。该前药是通过将与抗CD3部分结合的peptide mask与TriTAC的N-末端的蛋白酶可切割的连接子结合在一起而制备。连接子被蛋白酶切割后被释放。在NHP中，TriTAC-XR显示细胞因子的产生显著减少，同时保持了与非掩蔽TCE类似的药效学特性。目前，TAK-186 （EGFR/CD3/HSA）是第一个也是唯一一个在EGFR+实体瘤患者的临床试验中进行研究的具有条件性激活的三特异性TCE(NCT04844073)。
针对一个(或两个)激活的NK细胞受体和TAA的多特异性分子构成了另一种类型的ICE（Immune cell engagers），开发用于增强NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。在激活NK细胞受体中，根据其触发静息NK细胞的能力：CD16>NKp46>NKG2D。大多数针对NK细胞上CD16(FcγRIIIa)的构建物包含CD16特异性单链抗体部分，而不是CD16的天然配体IgG Fc结构域，以避免与Fc结构域相关的副作用。此外，用单链抗体直接结合NK细胞上的CD16比结合Fc结构域的CD16更有效，甚至有更好的安全性。
与TCE一样，NKCE抗体也同时设计与两种不同的TAA结合，以增加其治疗窗口。例如， Kügler等人构建了CD33/CD16/CD123 TsAb，用于双靶向AML细胞。结果发现，其对原代白血病细胞的NK杀伤作用明显强于三价BsAb CD123/CD16/CD123。
另一种CD16靶向的三特异性四价抗体形式被称为aTriFlex，用于将NK细胞对两种抗原表达的多发性骨髓瘤细胞毒重定向。这种形式包括一个抗CD16的单特异性双链抗体，两端有两个单链抗体，一个是抗BCMA的，另一个是抗CD200的。研究结果表明，多发性骨髓瘤细胞的双重靶向导致了选择性增加以及17倍的效力增强。
开发多功能NKCE的另一个平台被命名为Trinket。DF1001（HER2/CD16/NKG2D）是其中的代表药物之一。目前正在进行I/II期试验。
替代抗体构建多特异性的一种选择是使用非免疫球蛋白支架作为构建块。目前主要的支架蛋白平台中有anticalins, affibodies 和DARPins.。DARPins是基于自然产生的锚蛋白重复结构域，这些重复结构域构成了一个可产生多特定蛋白的支架。目前已有两种三特异性DARPins正在进行临床试验：MP0310(CD137/FAP/HSA)和MP0317(CD40/FAP/HSA)。
四特异性抗体(TtsAb)也不在停留在概念阶段。百利药业已有三种四特异性TCE已进入临床阶段：GNC-038(CD3/41BB/PD-L1/CD19)，正在对NHL(NCT04606433)和DLBCL(NCT05192486)患者进行I期临床试验；GNC-035(CD3/4-1BB/PD-L1/ROR1)用于治疗乳腺癌患者；GNC-039(CD3/4-1BB/PD-L1/EGFRvIII)用于治疗胶质瘤患者 (NCT05160545)。
小编小结
为了克服双特异性抗体的一些限制，人们已致力于多特异性抗体的开发，来解决癌症的复杂生物学问题。
从医疗费用的角度来看，多特异性抗体也有一定的吸引力，因为单一的治疗药物可以获得与不同的单抗组合类似(或更好)的治疗效果。尽管在生产中遇到了挑战，但多特异性抗体被赋予了前所未有的特性，这可能使它们有望成为更有效的癌症治疗生物制剂。
参考文献
1.When three is not a crowd: trispecific antibodies for enhanced cancer immunotherapy.
2.A novel CD19/CD22/CD3 trispecific antibody enhances therapeutic efficacy and overcomes immune escape against B-ALL.
3.A recombinant trispecific single-chain Fv derivative directed against CD123 and CD33 mediates effective elimination of acute myeloid leukaemia cells by dual targeting.
4.Trispecific antibodies enhance the therapeutic efficacy of tumor-directed T cells through T cell receptor co-stimulation.
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