9208 生物指示剂耐受性检查法指导原则

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　　生物指示剂的耐受性是指其所含的微生物能够耐受各种灭菌程序的能力。一般来说，生物指示剂的耐受性用D值来表示。D值是指将试验微生物杀灭90%所需的灭菌时间或灭菌剂量。生物指示剂的主要质量参数包括总芽孢数、D值和存活时间、杀灭时间。

　　本指导原则用于指导生物指示剂的耐受性以及相关质量参数的测定，也可用于生产过程污染微生物的耐受性测定。

　　　　　　　　　　　　　　　　　总芽孢计数

　　培养基

　　芽孢计数可用胰酪大豆胨琼脂培养基或其他适宜的培养基。胰酪大豆胨琼脂培养基照无菌检查法（通则1101（

通则1101））制备，其他培养基照生物指示剂使用说明书进行制备。芽孢计数用培养基应进行培养基适用性检查。

　　稀释液

　　灭菌纯化水（或其他经过验证的无菌溶液）。

　　芽孢悬液制备

　　芽孢悬液制备方法如下，如果下列方法经确认不适用，应建立其他适宜的方法。

　　根据生物指示剂的载体和初级包装情况，采取适宜的制备方法将载体上的细菌芽孢充分洗脱并混悬于稀释液中。

　　液体芽孢悬液生物指示剂　将芽孢悬液生物指示剂样品充分混匀后，或经过超声处理后，取1ml，用稀释液制成1︰10的供试液。

　　纸质载体生物指示剂或自含式生物指示剂　取不少于4个最小单位生物指示剂，将纸片载体从初级包装中取出，置适量的稀释液中，采用搅拌、涡旋或其他适当的方式，使容器里的纸片成纤维状（建议至少需要15分钟的浸泡和搅拌以使芽孢能充分回收），充分混合制成均一的混悬液。

　　非纸质载体的生物指示剂　取不少于4个最小单位的生物指示剂，将载体从初级包装中取出，置适量的稀释液中，可采用超声波（振荡器）反复振摇，或其他适宜的方法将载体上的芽孢充分分散于稀释液中。

　　热激活处理

　　取上述制备的芽泡悬液10ml，置灭菌试管中，按照表1的要求进行热激活处理，时间达到后将芽砲悬液转移至0～4℃的冰水浴中迅速冷却至室温。

　　培养和计数

　　取上述经热激活处理的芽孢悬液，用灭菌纯化水进行10倍系列稀释，采用倾注法或涂布法进行芽孢计数。

　　倾注法即取芽孢数在30～300cfu/ml稀释级的芽孢悬液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃融化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。涂布法即取适量（通常15～20ml）温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥，每一平皿表面接种芽孢数30～300cfu（接种量不少于0.1ml）。每稀释级至少制备2个平板。

　　按照表1推荐的培养温度和培养时间培养。逐日点计和记录各平板的菌落数，并计算每个最小单位生物指示剂的平均芽孢数。

　　结果判定

　　生物指示剂的总芽孢数一般为标示值的50%～300%。

　　　　　　　　　　　　　　表1　生物指示剂的芽孢计数的试验条件*

　　*芽孢计数亦可按照经验证的试验条件进行。

　　　　　　　　　　　　　　　　　D值测定

　　仪器

　　用于不同灭菌方法生物指示剂的D值测定一般采用不同的仪器或程序。湿热灭菌用生物指示剂的D值测定常用的设备有两种，一种是抗力仪（能够实现短时升温和降温的灭菌器），该设备适用于纸片式、自含式、芽孢悬液形式等的生物指示剂。另一种是油浴仪（能够设定到100℃以上的恒温设备），该设备适用于芽孢悬液生物指示剂。为保证测定结果的准确性，抗力仪的各项参数应满足GB/T24628（医疗保健产品灭菌　生物与化学指示剂　测试设备）的要求。

　　测定方法

　　生物指示剂的D值测定可采用阴性分数法（常用LHSKP法）或残存曲线法，测定方法参见GB18281.1（医疗保健产品灭菌　生物指示物第1部分：通则）。

　　阴性分数法　取不少于5组生物指示剂，每组数量相同（一般不少于20支），将每组生物指示剂暴露于特定灭菌条件下，各组对应的灭菌时间（剂量）递增，其余灭菌工艺参数应保持一致。相邻2组灭菌时间（剂量）间隔相同，一般不大于标示D值的75%。在不少于5组的生物指示剂中，至少1组在灭菌后培养各支均呈阳性；2组在灭菌后培养部分呈阴性，部分呈阳性；2组在灭菌后培养各支均呈阴性，详见表2。生物指示剂灭菌后培养条件应与产品使用说明中的培养条件一致。根据各组的阴性与阳性结果来计算D值。

　　计算公式：

　　（1）直至全部为阴性结果的平均灭菌时间（剂量）（UHSK）计算公式。

　　式中Uk为最初显示全部样品为阴性结果的灭菌时间（剂量）。

　　d为相邻2组的灭菌时间（剂量）间隔。

　　n为每组灭菌时的样品数量（每组的样品数量应相同，例如20）。

　　ri为每组灭菌后培养为阴性结果数量。

　　（2）D的平均值方的计算公式。

　　式中N0为总芽孢数。

　　（3）变量V和标准偏差（SD）的计算公式。

　　残存曲线法　取不少于5组生物指示剂（每组不少于4支），其中有1组不经灭菌处理，其余每组暴露于特定灭菌条件下，至少有1组灭菌后芽＞芽孢数下降不少于4lg值，其余3组的灭菌条件介于上述2组之间。将上述5组生物指示剂按照“总芽孢计数”的方法进行芽孢计数，以每组计数结果的平均值作为该组的芽孢数。以灭菌时间（剂量）作为横坐标，以芽孢数的对数值为纵坐标作图，并进行直线拟合（或用最小二乘法进行回归分析），进行回归分析或直线拟合时剔除不合理的数据点（灭菌后芽孢数lg值下降未超过0.5的数据点），所得直线斜率的负倒数即为D值。

　　　　　　　　　　　　　　　　存活时间和杀灭时间的确认

　　生物指示剂的耐受性D值可以用存活时间和杀灭时间来确认。

　　仪器

　　见D值测定项下“仪器”。

　　存活时间

　　测定时，将生物指示剂暴露于灭菌条件下一定时间（尽可能长时间）后，使所有生物指示剂培养结果均为阳性。存活时间可以按下式计算。

　　存活时间≥D值×（lgN0－2）式中N0为单位生物指示剂的初始芽孢数。

　　杀灭时间

　　测定时，将所有生物指示剂暴露于灭菌条件下一定时间（尽可能短时间）后，使所有生物指示剂培养结果均为阴性。杀灭时间可以按下式计算。

　　杀灭时间≤D值×（lgN0＋4）

　　式中 N0为单位生物指示剂的初始芽孢数。

　　存活时间和杀灭时间的确认

　　根据说明书中标示的或计算出的存活时间或杀灭时间，取两组生物指示剂（每组不少于10支），其中一组按照存活时间进行灭菌，另一组按照杀灭时间进行灭菌，灭菌后按照表1的条件或使用说明中的培养条件进行培养，并观察结果。

　　存活时间组的培养结果均应为阳性。杀灭时间组的培养结果均应为阴性。

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