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3525 人粒细胞刺激因子生物学活性测定法
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(NFS-60细胞/MTT比色法)
本法系依据小鼠骨髓白血病细胞(NFS-60细胞)的生长状况因人粒细胞刺激因子(G-CSF)生物学活性的不同而不同，以此检测G-CSF的生物学活性。
试剂 (1)RPMI1640培养液 取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素105IU和链霉素105IU，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液 量取新生牛血清100ml，加入RPMI1640培养液900ml中。4℃保存。
(3) 完全培养液 基础培养液中加入人粒细胞刺激因子至最终浓度为每1ml含10~20ng。
(4)PBS称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液 称取MTT粉末0.10g，溶于PBS 20ml中，配制成每1ml含5.0mg的溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
(6)裂解液 量取盐酸14ml、TritonX-100溶液50ml，加异丙醇，配制成500ml的溶液。室温避光保存。
标准品溶液的制备 取人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品，按说明书复溶后，用基础培养液稀释至每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备 将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每1ml含50~300IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
测定法 NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×105~4.0×105个细胞，传代后24~36小时用于生物学活性测定。将试验所用溶液预温至37℃。取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NF-60细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含2.0×105个细胞的细胞悬液，置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养40~48小时。每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。每孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算结果：
式中Pr为标准品生物学活性，IU/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
注：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法。
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