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赖脯胰岛素
纠错
分子式：C257H383N65O77S6
分子量：5807.57Da
本品系由含有可高效表达赖脯胰岛素基因的工程化细胞，经发酵、分离、高度纯化、结晶和干燥制成的原料药。赖脯胰岛素为28B-L-赖氨酸-29B-L-脯氨酸-人胰岛素，在结构上将人胰岛素B链第28位脯氨酸和第29位赖氨酸互换，形成Lys（B28）、Pro（B29）。按干燥品计算，每1mg含赖脯胰岛素应不低于27.0单位。
每1单位赖脯胰岛素相当于0.0347mg。
1 基本要求
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程细胞
工程菌菌种名称、来源及种子批检定应符合批准的要求。
2.2 原料
2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批细胞接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养。
2.2.2 发酵用培养基
采用适宜的不含抗生素的培养基。
2.2.3 种子液接种及发酵培养
2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液
2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶解氧、补料、发酵时间等。如系大肠埃希菌表达，发酵液应定期进行质粒丢失率检查（通则3406）。
2.2.4 发酵液处理
用适宜的方法收集、处理细胞。
2.2.5 初步纯化及高度纯化
采用经批准的纯化工艺进行初步纯化和高度纯化，使其纯度达到规定的要求。
2.2.6 过滤、结晶及干燥
经初步纯化和高度纯化后，釆用经批准的结晶工艺及干燥工艺对纯化收集物进行除菌过滤、结晶和干燥，干燥品即为赖脯胰岛素原料药。
2.2.7 分批
应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。
2.2.8 包装
应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。
3 检定
3.1 性状
本品为白色或类白色粉末。
3.2 鉴别
3.2.1 在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
3.2.2 取本品适量，用0.1%三氟乙酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH7.3）98μl、0.1%V8酶溶液4μl与水78μl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加85%磷酸3μl，作为供试品溶液；另取赖脯胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照含量测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（90∶10）为流动相A，乙腈-水（50∶50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱。
取对照品溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致，片段Ⅱ与片段Ⅲ之间的分离度不小于3.4，片段Ⅱ与片段Ⅲ的拖尾因子均不得过1.5。
3.3 检查
3.3.1 有关物质
取本品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并制成每1ml中含3.5mg的溶液，作为供试品溶液。取供试品溶液适量，室温放置，使A21脱酰胺赖脯胰岛素含量为0.8%～11.0%，作为系统适用性试验溶液。照含量测定项下的色谱条件，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（pH2.3）-乙腈（82∶18）为流动相A，乙腈-水（50∶50）为流动相B，按下表进行梯度洗脱。
取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，调节流动相比例使赖脯胰岛素主峰的保留时间约为41分钟，A21脱酰胺赖脯胰岛素峰的保留时间在线性梯度开始之前。赖脯胰岛素主峰和A21脱酰胺赖脯胰岛素峰之间的分离度应不小于2.5，拖尾因子应不大于2.0。另取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算，A21脱酰胺赖脯胰岛素峰不得过1.00%，其他任何单个杂质峰不得过0.50%，其他杂质峰面积之和（不包括A21脱酰胺赖脯胰岛素）不得大于2.00%。
3.3.2 高分子蛋白质
取本品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并制成每1ml中约含4mg的溶液，作为供试品溶液。照分子排阻色谱法（通则0514）试验，以亲水硅胶为填充剂（5～10μm）；冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15∶20∶65）为流动相，流速为0.5ml/min；检测波长为276nm。取赖脯胰岛素适量，室温放置10～20天，使高分子蛋白质含量不小于0.4%（或取人胰岛素单体-二聚体对照品适量），用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含4mg的溶液；取100μl注入液相色谱仪，赖脯胰岛素单体-二聚体（或人胰岛素单体-二聚体）的分离度应符合要求。取供试品溶液100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，扣除保留时间大于赖脯胰岛素主峰的其他峰面积，按峰面积归一化法计算，保留时间小于赖脯胰岛素主峰的所有峰面积之和不得大于0.25%。
3.3.3 锌
精密称取本品适量，加0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含锌0.4～0.8μg的溶液，摇匀。另精密量取锌单元素标准溶液适量，用0.01mol/L盐酸溶液分别稀释成每1ml中锌含量为0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg和1.0μg的锌标准溶液。照原子吸收分光光度法（通则0406第一法（
通则0406第一法）），在213.9nm的波长处测定吸光度，按干燥品计，锌含量应为0.3%～0.6%。
通则0406第一法）），在213.9nm的波长处测定吸光度，按干燥品计，锌含量应为0.3%～0.6%。 3.3.4 干燥失重
取本品0.2g，105℃干燥至恒重，减失重量不得过10.0%（通则0831（通则0831））。
通则0831））。 3.3.5 炽灼残渣
取本品约0.2g，依法检查（通则0841（通则0841）），以干燥品计，遗留残渣不得过2.5%。
通则0841）），以干燥品计，遗留残渣不得过2.5%。 3.3.6 微生物限度
取本品0.3g，依法检查（通则1105（通则1105）），每1g供试品中需氧菌总数不得过100cfu。
通则1105）），每1g供试品中需氧菌总数不得过100cfu。 3.3.7 细菌内毒素
取本品，依法检查（通则1143（通则1143）），每1mg赖脯胰岛素中含细菌内毒素的量应小于10EU。
通则1143）），每1mg赖脯胰岛素中含细菌内毒素的量应小于10EU。 3.3.8 宿主蛋白质残留量
3.3.9 宿主DNA残留量
取本品适量，依法检查（通则3407（通则3407）），或采用经批准的方法检查，每1.5mg赖脯胰岛素中宿主DNA残留量不得过10ng。
通则3407）），或采用经批准的方法检查，每1.5mg赖脯胰岛素中宿主DNA残留量不得过10ng。 3.3.10 抗生素残留量
如种子液制备及后续生产使用了抗生素，依法检查（通则3408（通则3408）），或采用经批准的方法检查，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
通则3408）），或采用经批准的方法检查，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。 3.3.11 生物学活性（至少每年测定一次）
3.3.12 N末端氨基酸序列（至少每年测定一次）
取本品，用氨基酸序列分析仪或其他适宜的方法测定。
A链N末端15个氨基酸序列：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln；
B链N末端15个氨基酸序列：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。
3.3.13 单链前体
工艺中如有单链前体，应采用经验证并批准的方法及限度进行控制。
3.4 含量测定
照高效液相色谱法（通则0512（通则0512））测定。
通则0512））测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（3μm），以0.2mol/L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加水800ml，溶解后，用85%磷酸调节pH值至2.3，加水至1000ml，过滤）-乙腈（74∶26，或其他适宜比例）为流动相；流速为1.0ml/min；柱温40℃；检测波长为214nm。取系统适用性试验溶液（取赖脯胰岛素对照品适量，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并制成每1ml中含1mg的溶液，室温放置，使A21脱酰胺赖脯胰岛素含量为0.8%～11.0%）20μl，注入液相色谱仪，调节流动相比例，使赖脯胰岛素主峰保留时间约为20分钟，赖脯胰岛素主峰与A21脱酰胺赖脯胰岛素峰之间的分离度应不小于3.0，主峰拖尾因子应不大于1.5，且连续进样三针的RSD%不得过1.1%。
测定法 取本品适量，精密称定，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含20单位的溶液（临用新配），精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取赖脯胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
4 保存、运输及有效期
避光，密闭，在-15℃及以下保存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。
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