3307 黄热减毒活疫苗猴体试验

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　　本法用于黄热减毒活疫苗种子批毒种检定。猴体试验包括嗜内脏性试验、嗜神经性试验和免疫原性试验。

　　试验用动物为恒河猴，应为健康，无脑内或脊髓内接种史，经检测应无黄热病病毒抗体，且不得经其他途径接种如神经病毒或与黄热病病毒有关的抗原。分别设实验组和对照组，每组动物应不少于10只。实验组动物注射主种子批毒种，剂量为每侧丘脑0.25ml(5000～50000LD50)；对照组动物注射参考病毒，供试品的病毒滴度和参考病毒的病毒滴度应尽可能接近。注射后应至少连续观察动物30天。

　　嗜内脏性试验 注射后第2、4、6天各采血1次并分离血清，将血清按1:10、1:100和1:1000的稀释度进行接种，每个稀释度至少接种4个细胞培养容器，测定病毒滴度。血清中病毒含量应不超过500(2.7 lg)IU/0.03ml，且最多有一份血清中病毒含量高于100(2.0 lg)IU/0.03ml。

　　嗜神经性试验 实验组猴子应与10只注射了参考病毒的对照组猴子进行比较，观察脑炎的临床症状以及神经系统组织损害程度上的差异。注射供试品和参考病毒的猴子，其发热反应的发作和持续期应无差异。

　　(1)临床评价由熟悉灵长类动物脑炎临床症状的实验人员每天检查猴子，连续检查30天(如需要，从笼中放出猴子进行运动减弱征兆或痉挛状态检查)。如果注射种子批毒种的猴子其脑炎严重症状(如麻痹或受激时无法站立)的发生率或死亡率高于注射参考病毒的猴子，则该种子批毒种不可接受。采用分级方法对脑炎症状和其他症状(如轻瘫、共济失调、嗜睡、震颤或痉挛)评定严重程度的分值。根据下列量表每天给每只猴子进行临床评分：

　　1级皮毛粗糙，不进食；

　　2级声音尖锐、不活动、行动迟缓;

　　3级走路摇晃、震颤、共济失调、四肢无力；

　　4级无法站立、四肢瘫痪或死亡(死猴从死亡之日至第30天每天的评分为4)。

　　每只猴子的临床评分为每天评分的平均值；一组猴子的临床评分为该组中每只猴子评分的算术平均值。如果接种种子批毒种的一组猴子其临床严重程度评分的平均值显著大于(P=0.95)注射参考病毒的一组猴子，则该种子批毒种不可接受。此外，在确定种子批毒种的可接受性时，还要特别注意每只动物是否出现严重征兆。

　　(2)组织学评价对大脑进行5个平面的考察。

　　I区纹状体视交叉平面；

　　II区丘脑-乳头体平面；

　　Ⅲ区中脑上丘平面；

　　IV区脑桥和小脑上橄榄核体平面：

　　V区延髓下橄榄核体中部平面。

　　将脊髓颈膨大和腰膨大分别等分为6个部分；用石蜡包埋和棓花青染色组织块并制备15μm切片。给脊髓和大脑的每一个横断面组织学结构打分。损伤评分如下：

　　1级一一轻度1～3个炎性浸润小病灶；几个神经元变性或丢失；

　　2级——中度4个及以上炎性浸润病灶；受累神经元变性或丢失不超过细胞总数的1/3；

　　3级——重度中度病灶或弥散性炎性浸润；2/3以上神经元变性或丢失；

　　4级一一最严重可变但通常为重度的炎性反应；90%以上神经元变性或丢失。

　　通过计算每个横断面解剖结构中鉴别区域(与黄热病病毒复制相关的病变区域)和目标区域(与黄热病病毒复制不相关的病变区域)损伤分级的分值，确定种子批毒种的嗜神经性试验组织学评价是否符合要求。实验组猴子单独鉴别区域或鉴别区域加目标区域两组总平均分值显著大于(P=0.95)注射参考病毒的对照组猴子总平均分值，则该种子批毒种的嗜神经性试验组织学评价不可接受。

　　猴体临床评价和组织学评价均符合要求，毒种的嗜神经性试验判为合格。

　　免疫原性检查 猴子经注射后3～4周釆血，分离血清测定中和抗体，10只猴子中至少有9只猴子血清中和反应阳性(抗体效价＞1:10为阳性)。在30天的观察期中，发现脑炎症状或因此而死亡的猴子不得超过1只，动物非特异性死亡应不超过10%。

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