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3535 康柏西普生物学活性测定法
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一、生物学活性测定法(报告基因法)本法系使用稳定转染了血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)基因和荧光素酶报告基因luc2P的人胚肾细胞(HEK293)，通过不同浓度康柏西普阻断血管内皮生长因子(VEGF)刺激细胞荧光素酶的表达情况不同，测定康柏西普的生物学活性。
试剂 (1)DMEM测试培养基量取胎牛血清10m1，加DMEM培养液至1000ml，2~8℃保存
(2)磷酸盐缓冲液(PBS)称取NaC1 8.01g、KC10.20g、NazHPO4·12H0 3.58g、KHPO、0.27g，溶解于800ml水中，调节pH值至7.5±0.1，定容至1L0.2um 滤膜过滤除菌后保存于无菌容器中，2~8℃保存。
(3)重组人血管内皮生长因子(rhVEGF165)浓缩液根据所需体积，取商品化rhVEGF165，用PBS稀释至终浓度为50μg/ml，-30~-15rhVEGF165保存。
(4)rhVEGF165工作液-1 根据所需体积，取 rhVEGF165浓缩液，用 DMEM 测试培养基释至终度为100ng/ml,现配现用。
(5)rhVEGF165工作液-2 根据所需体积，取rhVEGF165工作液，用DMEM测试培养基稀释至终浓度为50ng/ml,现配现用。
(6)显色底物 商品化荧光素酶作用底物。
(7)标准品 康柏西普眼用注射液标准品。
标准品与 rhVEGF165 混合溶液的制备 取康柏西普眼用注射液标准品，用DMEM测试培养基预稀释至30 000ng/ml后，再向下稀释至 1.21ng/ml，共计11个浓度梯度。将11个梯度标准品分别与rhVEGF165工作液1等体积混合，于37℃±1℃、5%二氧化碳条件下孵育20~40分钟，每个梯度做2孔。
供试品与rhVEGF165混合溶液的制备 用DMEM测试培养基将供试品预稀释至30000ng/ml，再用DMEM测试培养基按与康柏西普眼用注射液标准品相同的稀释梯度向下稀释共计 11个浓度梯度，将 11个梯度供试品分别与rhVEGF165工作液等体积混合，于室温条件下育20~40分钟，每个梯度做2孔。
测定法 取HEK293细胞，用DMEM测试培养基配制成5x105cells/ml的细胞悬液后接种于白色不透明的96孔细胞培养板中，每孔接种 80μl。分别加人不同浓度标准品混合溶液或供试品混合溶液，每孔 20μl，于37℃±1℃、5%二氧化碳条件下培养 5.8~6 小时。室温平衡 10~15 分钟，每孔加入显色底物 100μl，室温放置 3~5 分钟后，立即放人酶标仪使用化学发光模块测定每孔的荧光响应值。以细胞孔中加入rhVEGF165工作液-2作为阳性对照，细胞孔中加人DMEM测试培养基作为阴性对照，同法测定，记录实验结果。
采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，以供试品和标准品浓度为横坐标，以荧光响应平均值为纵坐标绘制四参数曲线，计算供试品和标准品的半数有效浓度(EC50。)按下式计算供试品相对生物学效价。
供试品相对生物学效价(%)=标准品 EC50÷供试品EC50x100%
实验有效标准：供试品和标准品四参数曲线均近似于 S形，且出现明显上下平台，拟合度 R2大于0.95;阳性对照与阴性对照荧光响应比值不小于 3。
结果判定 供试品生物学活性效价应为标准品的60%~140%。
二、相对结合活性测定法
本法系使用酶联免疫吸附法(ELISA 法)检测不同浓度康柏西普在包被人血管内皮生长因子(VEGF)的酶标板上的吸附，测定康柏西普的相对结合活性。
试剂 (1)碳酸盐缓冲液称取 Na2CO3。1.59gNaHCO32.93g，溶解于 1000ml水中，使用前用 0.2μm 孔径能聚过油2~8℃保存。
(2)磷酸盐缓冲液(PBS) 称取 NaC1 8.01g、KC1 0.20g、Na2gHPO4·12H20 3.58g、KH2PO4，0.27g，解于800ml水中，调节 pH值至7.5±0.1，定容至1L，2~8℃保存。
(3)rhVEGF165 储备浓缩液 取一支商品化的rhVEGF165，加人PBS，制备终浓度为50μg/ml的rhVEGF165储备浓缩液，-15℃及以下保存。
(4)包被工作液取rhVEGF165储备浓缩液加入碳酸盐缓冲液中混匀，终浓度为0.125ug/ml，现配现用。
(5)洗液 根据所需体积，量取聚山梨酯20 溶于 PBS终浓度为0.05%(V/V)，2~8℃保存。
(6)封闭液和样品稀释液 根据所需体积，称取牛血清白蛋白溶于 PBS，终浓度为 1%(W/V)，2~8℃保存。
(7)检测抗体 辣根过氧化物酶标记的人 IgG-Fc 抗体2~8℃保存。
(8)显色液四甲基联苯胺显色试剂，28℃保存
(9)终止液 2mol/L硫酸，常温保存。
(10)标准品 康柏西普眼用注射液标准品
供试品、标准品准备 取供试品和标准品，分别用样品稀释液预稀释至1600ng/ml后，再向下稀释至0.005ng/ml，共计 11个浓度梯度。
测定法 用包被工作液按 100μl/孔包被酶标板，封板胶封板后室温静置 16~20 小时，之后弃去酶标板孔内液体用洗液洗板3次。用封闭液按300pl/孔加入酶标板中，封板胶封板后 37℃±1℃孵育 2小时，之后洗板3次。将供试品、标准品各浓度梯度分别按 100μl/孔加人酶标板中，各两个复孔，封板胶封板后37℃±1℃孵育 1小时，之后洗板 3次。将检测抗体用封闭液稀释至50μg/ml，按 100μl/孔加人酶标板中，封板胶封板后37℃±1℃孵育1小时，之后洗板3次。将显色液按 100μl/孔加人酶标板中，室温避光显色，之后将终止液按 50μl/孔加人酶标板终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度(OD450)。
采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，以标准品和供试品浓度为横坐标，以 OD450平均值为纵坐标，作四参数曲线并计算供试品和标准品的半数抑制浓度(IC。，按下式计算供试品相对结合活性。
供试品相对结合活性=标准品IC50÷供试品IC50x100%
实验有效标准：供试品和标准品四参数曲线均近似于S型，且出现明显上下平台，拟合度 R2不低于0.99;样品和标准品最高 OD值(MeanValue)在1.5~2.5之间;标准品与待测样品的上渐近线(四参数曲线的 D值)比值为0.80~1.25;标准品与待测样品的下渐近线(四参数曲线的 A值)比值为 0.60~1.67 之间;标准品与待测样品斜率(四参数曲线的B值)的比值在 0.80~1.25 之间;前7个浓度点，两复孔OD值的CV%≤15%。
结果判定
供试品相对结合活性应为标准品的 60%~140%。
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